文献解读：利用单细胞RNA-seq揭示胰腺导管腺癌恶化过程中肿瘤微环境的动态变化 | 单细胞专题

当当当当！

今天想给大家推荐的是一篇关于单细胞测序的文章，题目是利用单细胞RNA-seq揭示胰腺导管腺癌恶化过程中肿瘤微环境的动态变化。（小声bibi：私以为这是一篇非常适合刚入门单细胞测序的小白阅读的文献）。

1.背景 BACKGROUND

胰腺导管腺癌(PDAC)是所有胃肠道肿瘤中最具侵袭性的。 

PDAC复杂的肿瘤内部异质性和特殊的肿瘤微环境为制定有效的治疗方案策略带来了巨大的挑战。因此，作者的目的是希望能通过单细胞RNA-seq来探索PDAC恶化过程中肿瘤微环境的动态变化。

2.方法 METHODS

作者准备了共计11个样本(4个PDAC I, 4个PDAC II, 3个PDAC III) ，从这些样本中分离出单细胞后（总计18555个细胞）再经过10X单细胞RNA-seq技术得到原始数据，再经过QC，标准化，降维后获得高质量数据，最后再联合一系列生信分析进行数据挖掘。

当然细胞种类有不少，但是作者的重点关注对象就是以下这三种细胞：导管细胞，免疫细胞（包括调节性T细胞，调节性B细胞，癌症相关巨噬细胞）和癌症相关成纤维细胞。那么这三种细胞到底在PDAC中扮演着什么样的角色，起到了怎样的作用，又有什么变化呢？

接下来就请大家带着疑问继续读下去

3.结果 RESULTS

3.1总体 OVERALL

根据PDAC I, PDAC II和PDAC III的三幅t-SNE图可以看到，一共确定了9个不同的cluster，包括导管细胞、巨噬细胞、B细胞、内皮细胞、星状细胞、T细胞、成纤维细胞、腺泡细胞和内分泌细胞。

当然我们的重点关注对象也是包含其中的。作者还贴心地将这三种细胞的数量占比做了统计，并绘制了柱状堆叠图。从图中我们可以看到，除了免疫细胞的数量从PDAC早期到晚期有所积累，导管细胞和成纤维细胞的数量占比都是逐级下降的。

但是数量占比的变化也证明不了太多，别急，接下来我们来逐个击破！

3.2导管细胞 DUCTAL CELL

都说是胰腺导管腺癌，这导管两字就在其中，那导管细胞不会就是主角吧？

当然可不敢就这靠这个妄下推断，但是从PDAC早期到晚期，涉及到的导管细胞种类确实是在变化，由下图可以明显看出这一点。

随后作者又调取了PDAC早期（图g）和PDAC中晚期（图f）的上调基因进行了GO分析：在PDAC早期，导管细胞还是在做着一个导管细胞该做的活，包括核糖体结构构建、细胞粘附分子结合、钙粘蛋白结合和rRNA结合；而到了PDAC中晚期，导管细胞就明显加入了肿瘤恶化过程，如细胞粘附，细胞因子活化，趋化因子受体结合，趋化因子活化和R-SMAD结合。

除此之外，作者利用上皮细胞marker (EPCAM)、间质细胞marker (FN1、MMP7和VIM)和癌症干细胞(CSC)marker (CD44、ALDH1A1和NOTCH2)进行了基因表达分析，结果显示，在PDAC早期，上皮细胞的表达量占优，而到了PDAC晚期，间质细胞和癌症干细胞的表达量有了明显增加，反观上皮细胞的表达量却在减少，这些数据进一步证明了上皮间质转化（EMT）和肿瘤干细胞特性随着肿瘤恶化逐渐积累的观点，从而促进了肿瘤的侵袭和转移。

3.3 免疫细胞 IMMUNE CELL

3.3.1 T细胞

提到免疫细胞，大多数人第一个想到的就是T细胞，T细胞的重要性已是毋庸赘述。如下t-SNE结果所示，作者共确定了11个T细胞的cluster，随后作者利用各种T细胞的标记基因确定了这些cluster对应的细胞类型，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th1/2、Treg、细胞毒性T细胞、效应T细胞、记忆T细胞和衰竭T细胞。PDAC II/III较PDAC I具有更多的细胞毒性T细胞、效应T细胞和记忆T细胞。当然调节性T细胞（Treg）和衰竭T细胞也是从PDAC早期开始就逐渐增加的。

接着，作者将Treg中含有的基因做了GO富集分析，结果发现Treg参与了不少负调控，如炎症反应负调控，外界刺激反应负调控和细胞因子形成负调控。

这边有人曾提出疑惑，为什么抗癌T细胞的数量增加了，却没有对PDAC起到抑制作用，这里小编用一幅漫画解释给大家看：

因此，抗癌T细胞的数量是增加了，但是因为受到了Treg和衰竭T细胞的负调控作用，导致抗癌T细胞一直处于“供不应求”的状态，这双拳难敌四手，也难怪病情更加严重了。

3.3.2 巨噬细胞

另一个重要的免疫细胞是巨噬细胞，其异质性在PDAC中尚不清楚。作者根据巨噬细胞的标记基因确定四种细胞类型后，统计了PDAC三个阶段中这些细胞的数量，其中包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、M1/2、CD169+巨噬细胞和TCR+巨噬细胞。TAM和M1/2到了晚期都比早期有所增长，跟T细胞分析时一样，虽然抗癌巨噬细胞M1的数量增加了，但因受到M2和TAM的负调控作用， M1的作用如同虚设。

3.3.3 B细胞

B细胞的结果算是最让人意外的了，首先从t-SNE图就可以发现，B细胞整体根本没有参与到PDAC早期中，另外B细胞中我们最关注的Breg（调节性B细胞）竟然在PDAC整个恶化过程中不见踪影（使用三个常见的Breg标记基因：CD1D，CD5，TGFB1后发现小提琴图里没有一个cluster对其有显著表达），可惜的是作者在这块也没有详尽的解释。

3.4 癌症相关成纤维细胞 CANCER ASSOCIATED FIBROBLASTS

现在就到了最需要隆重介绍的细胞——癌症相关成纤维细胞！

这时候你可能要问了，成纤维细胞有啥好特殊优待的？可它特殊就特殊在，作者找到了一种新型的，之前从没人发现过的成纤维细胞！但是小编现在就是不告诉你它叫啥，想知道答案，就看到最后吧。

由下图的t-SNE图可知，作者一共确定了三种成纤维细胞，其中cCAF就是普通的成纤维细胞 (classical CAFs)，PSC是胰腺星状细胞 (pancreatic stellate cells)，最后的csCAF就是我们这篇文献的主角，也就是作者发现的新型成纤维细胞。

另外由上图的堆叠图可以明显看到，到了PDAC晚期，仅剩下PSC一种成纤维细胞，不仅如此，PSC的数量在PDAC早中晚期的占比都是最多的，之前也确实有文献^[1]证实过，PDAC的特征就是具有由胰腺星状细胞和细胞外基质成分组成的致密间质。至于为什么到了晚期只剩下PSC一种细胞，作者在这里推测是到了晚期，csCAF和cCAF可能均转化成了PSC。

好了，关于成纤维细胞的大致情况说完了，现在大家应该迫不及待想知道这个神秘的csCAF到底是啥了吧？

那小编就带着大家看看作者是怎么命名它的：

作者在这里使用的工具是WGCNA（Weighted gene co-expression network analysis），它是一种描述基因之间相关联系的系统生物学方法。

Cytoscape软件把表达量top80的基因挑选出来做了network图，从图中可以看到显示黄色的基因——C3，C7，C1R，CFH和C1S，它们在这个network里起着关键作用，其中尤其是C3和C7，都是非常常见的补体分子。最后的GO和KEGG富集分析结果更是进一步证明了棕色模块里的基因跟补体系统的关系之密切。

这样“补体”的关键词有了，通过上述判断这极有可能是一种可以释放补体分子的新型成纤维细胞，于是，作者将其命名为complement-secreting CAFs，缩写csCAF。

能发现这样一种新型成纤维细胞当然是件激动人心的事，这不作者就紧接着想看看这种细胞能不能在PDAC早期被检测出来。作者利用成纤维细胞markerCOL1A1和补体分子C3，用RNA原位杂交(RNA ISH)（图a）和免疫荧光(IF)（图b）法对不同临床阶段的人的肿瘤组织的切片进行染色，从而进一步确定了csCAFs的存在，这些细胞仅存在于PDACI和II阶段，位于靠近恶性导管细胞的组织间质中。  

这说明csCAFs可能在PDAC微环境中对肿瘤起着抑制作用，并且在肿瘤恶化过程中数量确实是逐渐在减少。如下图作者的想象图所示，PSC像堡垒一样牢牢守护着肿瘤细胞，而在PDAC早中期，csCAF还存在的时候，它一直释放着补体分子想要击破堡垒，对里面的肿瘤细胞发动攻击。但是这些细胞的潜在价值仍然需要去进一步探索才能获知。

4.总结 CONCLUSION

那么最后就可以做出一个简单的总结了：

虽然确实还有很多东西没有确认，依然存在疑惑，但是小编认为，这篇文献的作者给我们看到了单细胞测序技术宽广且光明的未来。正所谓做设计，最怕的就是灵感枯竭，这句话同样可以放到实验设计上来，不管作者发现的这种新型癌症相关成纤维细胞对胰腺导管腺癌的治疗方案优化和创新是否有实质性作用，这都是我们该去探索的，也绝不能放弃的一个方向，因为它存在希望。

5.参考文献 REFERENCE

[1] Garrido-Laguna I, Hidalgo M. Pancreatic cancer: from state-of-the-art treatments to promising novel therapies. Nat Rev Clin Oncol 2015;12(6):319–34.

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